一、无菌检测

1 目的

建立产品无菌检测的操作方法规程与结果判定规则。

2 程序

2.1 设备和材料

2.1.1 设备

超净工作台、电热干燥箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、平板过滤器、三角瓶、酒精灯、剪子、灭菌镊子、灭菌剪刀。

2.1.2 试剂

营养琼脂培养基、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄。

2.2 试验前准备

2.2.1 器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃20min，或置电热干燥箱内180℃2h。

2.2.2 浸提介质磷酸盐缓冲液配制：1/15M磷酸盐缓冲液，Na₂HPO₄·12H₂O(分子量358.22)浓度为23.89g/l，KH₂PO₄(分子量358.22)浓度为9.08g/l。取1000mL去离子水，加入23.89g Na₂HPO₄·12H₂O和9.08gKH₂PO₄，完全溶解后与实验器具一起灭菌待用。

2.2.3 按配方配制营养琼脂培养基（含琼脂），采用高压蒸汽121℃灭菌20分钟。洗净培养皿，用电热干燥箱进行干热灭菌，180℃灭菌2小时。

2.2.4 在超净台中无菌操作，将灭菌后凉至45℃的营养琼脂培养基（含琼脂）倾倒入已灭菌的培养皿中，盖上盖后旋转培养皿使培养基均匀布满培养皿底部，待培养基凝固，制成培养平板待用。

2.2.5 按照说明书对直径为100mm、孔径为0.45μm的醋酸纤维脂膜进行预处理，并装入细菌集菌器，采用高压蒸汽121℃灭菌20分钟。

2.3 供试液制备

2.3.1 将过样品在超净台中无菌操作打开，然后用磷酸盐缓冲液冲洗过的100mL量筒量取若干毫升磷酸盐缓冲液注入样品，用力振荡样品10min以保证浸提全部微生物

2.4 试验方法

2.4.1 同一批号至少抽取3%的成品，所有操作在超净台中进行；

2.4.2 在超净台中将制备好的供试液从平板过滤器顶部进口倒入，开始进行过滤，注意不要让供试液从过滤器排气口溢出；

2.4.3 供试液完全倒入平板过滤器后静置60min，然后打开过滤器用无菌镊子取出已经收集到微生物的醋酸纤维脂膜。采用无菌操作，打开培养平板的盖，将醋酸纤维脂膜（收集到微生物的一面朝上）覆盖在培养基上，盖上盖，翻转平皿培养。

培养温度为35℃±1℃，培养时间72h±3h。

2.4.4 培养结束后，进行菌落计数，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

2.5 结果判定与处理

2.5.1 培养皿菌落计数结果不为零则本批产品无菌项目不合格，判定为不合格。

2.5.2 菌落计数为零则无菌项目合格。

二、热原检测

1 目的

建立产品热原检测的操作方法规程与结果判定规则。

2 程序

2.1 设备和材料

2.1.1 设备

超净工作台、电热干燥箱、霉菌培养箱、恒温水浴（37±1℃）、100mL量筒、三角瓶、酒精灯、剪子、灭菌镊子、灭菌剪刀。

2.1.2 试剂

细菌内毒素工作标准品，鲎试剂（灵敏度为0.25EU/mL），检查用水（内毒素含量小于0.05 EU/mL）。

2.2 试验前准备

与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内180℃干烤2h，塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。浸提液为工厂水处理设备生产的去热原水。

2.3 供试液制备

2.3.1将样品在超净台中无菌操作打开，然后用去热原水冲洗过的100mL量筒量取若干毫升去热原水注入，用力振荡样品10min以保证浸提全部内毒素。最后装入无菌包装封口后放入霉菌培养箱37±1℃保温120min待用

2.4 试验方法

2.4.1 同一批号至少3个单位供试品，用无热原水作为浸提介质。

2.4.2 配制内毒素工作标准品稀释液：取细菌内毒素工作标准品，加入1mL细菌内毒素检查用水溶解制成灵敏度为10EU/mL的试剂，取其中0.1mL加入到1.9mL的检查用水中制成0.5EU/mL的工作标准品，用作阳性对照。

2.4.3 取鲎试剂瓶3支，供试品组加入供试液0.1mL，阴性对照组加入0.1mL检查用水，阳性对照组加入0.1mL内毒素工作标准品稀释液，再各加入0.1mL检查用水充分溶解。轻轻混匀后用封口纸封闭管口，垂直放入37±1℃水浴或温箱中保温60±2min，轻轻取出并观察结果。

2.5 结果判定

2.5.1 将鲎试剂瓶缓慢倒转180º，瓶内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。

2.5.2 供试品为阴性（-）时，判定产品符合要求，热原合格。

2.5.3 供试品为阳性（+）时，判定产品不符合要求，热原不合格。

2.5.4 阴性对照组呈阳性时，本次试验结果无效，重复上述实验步骤。

2.6 结果的处理

A.      产品热原检测合格时，本批产品准予放行。

B.      产品热原检测不合格时，判为不合格品。