Three questions

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Build版在软件发布上主要用于区分不同时期的版本，它是编译时的版本标记，一般序号都是递增的。可用于辨别软件的版本。 版本号里面的Build说明这个版本是第几次编译的结果，它后面一般跟数字或日期。关于软件版本号，请参考下面介绍: [查看百科全文]

细胞总蛋白的提取

一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中，加入饱和浓度一抗(1/10)或

（10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000 转×3分，用PBS 0.4-0.5ml重悬(室

温),加入饱和浓度二抗（1/100）或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后

（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4

,5mM EDTA,10mM NaF））,

离心4000 转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度

108/ml？)吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml

的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细

胞溶解成分。

二．裂解缓冲液：

50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4

150-300mM NaCl

1％(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100)

5mM EDTA（现加1ml加10ul）

临用前加入蛋白酶抑制剂：

Na3VO4

钒酸钠 1mM (75mM—13.3ul/ml)

（用0.2mol/L储存液配制）

PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)

或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul）

Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml（10ul/ml）

(Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting

三．给你介绍一个裂解液：

50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含：

NaCl 150mM

叠氮钠 0.02%

SDS 0.1%

NP-40 1%

PMSF 100ug/ml（使用前临时加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)

尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS 上样buffer。

四．我的样品蛋白是这样制备的：

mRNA的分离

与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。

进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。

1）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。

2）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。

3）用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液

20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)

0.5mol/L NaCl

1mmol/L EDTA(pH8.0)

0.1％SDS

可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液；将适量无RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液（参见344页）混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌，待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 ％SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠

RNA酶活性的控制

为了获得高质量的真核细胞mRNA， 必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。

实验程序

RNA酶的抑制剂破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法

（一）实验程序

　　如不谨慎操作，外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA制品：

（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）

标本的收集与保存

临床检验常见的标本一般包括血液（指血，静脉血），尿，粪便，脑脊液，胸腹水，前列腺液，精液，阴道分泌物等，这些标本收集的时间、方法和保存都有一定的要求。

一、血液标本

    有些生理因素，如吸烟、进食、运动、情绪波动、妊娠、体位等均可影响血液中某些成分的变化，有些甚至还有昼夜变化。因此血液标本的采集应尽量避免生理因素干扰，以条件一致为宜，如无法避免，应在标本上注明该因素。

1．外周血

    一般选取左手无名指内侧采血，该部位应无冻疮，炎症，水肿，破损。如该部位不符合要求，以其他手指部位代替。对烧伤病人，可选择皮肤完整处采血。由于部分血液常规检测（如白细胞计数、分类等）受生理因素影响波动过大，比较时宜使条件尽量一致。涉及到体内出、凝血功能的检测项目（如血小板计数，出血时间或凝血时间等）的检测，一定要注意了解患者是否用过抗凝、促凝药物，以便在减少或避免干扰因素的影响。

2．静脉血

    除涉及各种止血和血栓检测等项目需采用抗凝静脉血血浆外，目前绝大多数检测项目的分析检测可直接采用静脉血的血清。在血清检测项目中，有些（如血糖，血脂等）受饮食及昼夜因素

1. 什么是western blot?

答：WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。

2. western blot 有什么优点？

答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。

3. western blot 的具体步骤是什么？

答：一. 制样（以提动物组织总蛋白为例），

1） 组织洗涤后加入3 倍体积PBS，0℃研磨。

2） 加入5×STOP buffer

3） 180W, 6mins，0℃超声波破碎

4） 5000rpm，5mins 离心，取上清。

5） 加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）

6） 煮沸，10min

7） 分装，于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

二． 电泳（SDS-PAGE）

建议欲检测抗原10－30kd, 用15％胶；30－100kd, 用10％胶；100－200kd，用7.5

％胶。

1）配胶（one piece）A.分离胶。单位：ml。Total: 8ml

7.5％ 10％ 15%

2×Sep. buffer 4 4 4

30％ Gel.sol 2.0 2.7 4

ddH2O 1.9 1.2 0

TEMED 8ul 8ul 8ul

10%APS 80ul 80ul 80ul

B. 浓缩胶。单位：ml。Total: 3.5ml

3％

2×Stacking. buffer 1.7

30％ Gel.sol 0.35

ddH2O 1.4

TEMED 5ul

10%APS 50ul

2)点样。上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm, 则

载荷面为：1mm×5mm=5mm2)，

3）电泳。开始用80V电压，但是当溴酚蓝至分离胶时，用100-120V电压。

4）转移（一块胶）。

A.半干法。

a. 取六张滤纸（Bio-Rad，1mm），三张做上层滤纸，三张

【目的和要求】

1、学习和掌握从培养细胞中提取RNA的原理和方法

2、掌握cDNA第一链合成的原理和方法

3、掌握PCR基因扩增的基本原理和使用PCR仪进行基因扩增的方法

【实验原理】

1、细胞总RNA的提取：

细胞内大部分RNA是与蛋白质结合在一起的，以核蛋白形式存在。因此，分离RNA时必须使RNA与蛋白质分离，由于RNA很容易被RNA酶降解，在提取过程中，使用RNA酶的抑制剂如：焦碳酸二乙酯（DEPC）、异硫氰酸胍等。Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。

2、RT（逆转录）：

RT是以分离纯化的RNA为模板，以dNTP为原料，在逆转录酶的作用下，以碱基互补配对为原则，合成RNA：DNA杂化双链，杂化双链中的RNA被RNA酶水解后，即可获得cDNA第一链。

3、PCR（聚合酶链反应）：

PCR是一种在体外选择性扩增基因片段的方法，其过程分为3个阶段：

①变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂，形成两条单链。变性温度一般用94℃。

②退火：降低温度，使模板DNA的两条链与引物按照碱基互补配对原则相结合，退火温度一般为GC含量较低的一条引物的Tm±5℃

【目的和要求】

1、了解电泳的基本原理；

2、掌握用琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法及其应用。

【实验原理】

   带电粒子在电场中可以向其所带电荷相反的电极的方向移动的现象，称为电泳。DNA分子在pH值高于其等电点的缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动,缓冲液pH值偏离等电点愈远，其所带的电荷愈多。在一定的电场强度下，不同的DNA片段的迁移速度不一样。其迁移速度主要取决于DNA的分子大小、所带电荷量等，分子量愈小、带电荷量愈多，迁移速度愈快，相同分子量的不同构型的DNA分子，其迁移速度也不一样。超螺旋质粒DNA的泳动速度最快，线状质粒DNA次之，开环质粒DNA泳动速度最慢。另外，同一种DNA分子，在浓度较高的琼脂糖凝聚中泳动速度较慢，在浓度较低的琼脂糖凝聚中泳动速度较快。

【试剂与配制】

1、50×TAE 缓冲液：

                    Tris                    242 g

                    乙酸                    57.1 ml

在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)或尿素，或SDS-尿素后，用其作支持物进行(分离检测大分子样品)的凝胶电泳称为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。此电泳可用于单链DNA、寡核苷酸片段以及蛋白质亚基、膜蛋白、肽类等物质的分析，还用于大分子物质的折叠结构等方面。    SDS是阳离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。此复合物可用聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常把这种电泳称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶(简称SDS—PAGE)。它的主要用途是分离蛋白质和测定其亚基的分子质量。    (一)基本原理    聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地分离不同类型蛋白质的主要依据是样品中各种物质的电荷和分子质量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低乃至消除。与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物电泳时的泳动率差异，就反映了分子质量的不同。在此条件下，样品分子质量的对数与其在凝胶中迁移率呈直线关系。公式如下：