下表列举了一些膜电位敏感荧光染料及其应用的例子。

荧光染料	类别	应用
苯乙烯基染料(styryl)	快，阳离子型或中性	神经元，脑，心脏细胞；电穿孔
苯乙烯基染料(styryl)	快，中性	可兴奋细胞，非兴奋性细胞
苯乙烯基染料(styryl)	快，阳离子型	突触体
羰花青(carbocyanine)	慢，阳离子型	膜电位成象
四甲基罗丹明及其酯 tetramethylrhodamine methyl & ethyl esters	阳离子型	线粒体电位
羰花青	慢，阳离子型	星形胶质细胞(astrocytes)，孢子外壁染色，活神经细胞突触前膜，内质网膜，    线粒体膜，成纤维细胞的循环，嗜中性白细胞和血小板粒的分泌。
部花青	慢，中性	光钝化被膜病毒，外周血白细胞，自体骨髓移植的体外净化。

4.2.5 金属代谢的荧光监测

由于钙，钾，钠，镁，锌等金属及其代谢在细胞活动中起着重要的作用，因此活体监测这些金属的代谢具有重要的意义。现在已经有了一些这样的方法，荧光标记法是其中应用比较方便的一种。

4.2.5.1 探测钙调节和第二信使活动的荧光探剂

有几类探测钙调节和第二信使活动的荧光探剂:

1. 钙的相似物:三氯化铽(TbCl3 6H2O)和其它一些三价镧系元素是钙的荧光类似物，可以在很多重要的蛋白，如钙调素，肿瘤调节因子(oncomodulimn)，乳清蛋白(lactalbumin)和ATP酶等蛋白研究中用来研究金属和蛋白质的相互作用。铽和钙调素的I，II位点结合得最紧密，而Nd3+可以淬灭Tb3+的荧光，并可用于估计钙调素位点III和IV之间的距离。

2. 钙的拮抗剂:有些荧光探剂是钙的拮抗剂，如D-1579可阻断平滑肌和骨骼肌肌质网内Ca2+的外泄，也可阻断肌醇三磷酸酯引起的燕麦根和血小板囊泡液泡膜内钙离子的泄漏，抑制氯甲酰胆碱激发的大鼠胰腺腺泡内的淀粉酶的释放(这种抑制作用很可能是由于阻断了细胞钙的运动；D-1579还可以强烈地抑制由K+引起的肾上腺肾小球细胞内钙的增加。

3. 钙的荧光标记: 现有的各种钙荧光探针都是不发荧光的钙螯合剂BAPTA的衍生物，

4.2.5.2 钠和钾的荧光标记

4.2.6 荧光探剂作为pH指示剂

由于有些荧光分子的荧光强度随溶液pH值有明显变化，因此可以利用这些荧光分子作为pH值的指示剂，尤其是那些只在较窄的pH范围内发光的荧光分子，更适合作为pH指示剂。

表 : 荧光pH指示剂举例（郭书P109表5－4）:

l        蛋白质折叠的热变性研究

温度可以对生物大分子的结构造成扰动，可以引起生物大分子不同结构之间的转化。生物大分子各种结构的平衡状态随温度的变化可以提供Gibbs自由能的各种参数如焓、熵、热容量等的相关信息。由于系统的焓是温度函数，因此对热焓的实验研究可以得到分配函数(partition function)，从而得到系统的一个完备的热力学描述。由于DSC可以提供这样的信息，它也提供了一种确定蛋白质折叠和去折叠转变的能力学和这些反应的热力学的可能技术。DSC可以直接测量溶液的热容，现在已经开发出有足够的灵敏度和精确度的可以测量稀蛋白质溶液的热容的仪器。热容本身包含了丰富的信息，与结构参数直接相关。

一般考虑

构象平衡的统计热力学表达

描述单体蛋白质构象平衡的最基本的量是分配函数Q，Q定义为某种蛋白质所有可能状态的统计权重的和：

                     (1)

这里exp(－DGi / RT)为统计权重或Boltzmann指数，DGI为每个状态的Gibbs自由能，R为气体常数，T为绝对温度。由于所研究的系统用粒子的某个常数和某个平均能量表征，式(1)可以等同于经典的分配函数。每个状态的Gibbs自由能由下面的标准热力学关系表示：

     (2a)

    (2b)

这里DHi(TR)和DSi(TR)分别为状态i在参考温度TR下的相对热焓和熵，DCp,i是该状态的相对热容量。方程2a是最普遍的方程，方程(2b)为经典的方程，其中假定状态之间的热容量之差是与温度无关的。为方便起见，选择自然状态(状态0)为参照状态，用于表示相对热力学参数。

所有热力学参数可以用分配函数来表示。平均系统自由能（áDGñ）等于

áDGñ ＝ －RT lnQ                  (3)

平均剩余焓(áDHñ)等于

áDHñ ＝ RT2（¶ln Q /¶T）              (4)

平均剩余熵áDSñ等于

áDSñ = RT（¶ln Q /¶T）+ R ln Q          (5)

系统自由能随温度的变化用来定义相变的特征。

平均系统性质

我们观测到的宏观物理性质包含了系统中所有分子的贡献，因此，如果按分子平均或按克分子(摩尔)平均进行归一化，则得到的是规范的集合的平均。除非特别说明，下面的讨论都是以摩尔平均为基础。例如，如果我们指定系统的某个物理量为a，则全部a的和aTotal如下：

aTotal＝                  (6)

ni为处于状态i的分子的数目，ai为状态i对观测量aTotal的贡献。观测量的摩尔平均值(áañ)由aTotal除以系统中分子的总摩尔数：

áañ ＝          (7a)

                                 (7b)

这里Pi是处于状态i的分子数，á ñ表示对整个集合的平均，以区别于对时间的平均。但对各态历经的系统来说，这两种平均是等价的。对一个规范集合来说，Pi等于这个状态的统计权重与所有状态统计权重的和之比：

Pi=           (8a)

Pi=exp(－ΔGi/RT)/Q                     （8b）

由此可以推出，整个集合的a平均值等于

áañ ＝                  (9)

方程(7)和(9)推出了一个系统某个任意的物理量与控制构象平衡的热力学参数之间的严格数学关系。除了热力学参数和它们的相关变量以外，一般来说ai和DGi之间没有什么关系。例如，如果这个参量是一个波谱学观测量，例如荧光量子产率或荧光偏振度，或者是园二色实验中的椭圆度，显然这些参量与自由能没有任何可以预测的关系。因此，公式(7)和(9)只有在最简单的情况下，即某个平衡只涉及两个状态时，才能精确求解。但是，如果这个可观测量是热焓，而且从DSC实验中得知是随温度变化的，则情况将有所不同。

两态平衡

对于只有两种状态的平衡的情况，方程(7)变成

áañ ＝P0a0+PNaN                      (10)

由于åPi＝1，

áañ ＝P0a0+PNaN＝(1－PN) a0+PNaN＝a0－PN a0+ PNaN＝a0+PN(aN－a0)

PN＝(áañ－a0)/ (aN－a0)        (11)

式(11)建立了可观测量a与系统的热力学参数之间的直接联系，因为在这种情况下，

exp(－DGN / RT )＝PN/ (1－PN)               (12)

对于反应 ， 式(12)等于平衡常数KN。对于两态平衡，式(11)得到的分布等于处于状态N的真实分子数目，因此得出的热力学参数也与正确的值相对应。但如果这个平衡涉及两个以上的状态，则上述结论不成立。在大多数情况下，虽然事先并不知道系统是否符合两态机制，仍用方程(11)和(12)进行热变性曲线的分析。因此，由这些方程得到的热力学参数常称为“视在”参数。此外，对于两态平衡，由式(11)和(12)得到的值与用来测量平衡的观测量的本质无关，即不同的观测量将给出同样的结果。Lumry及其合作者多年前就认识到这一事实，他们设计了一系列实验来检验许多情况下两态近似是否成立。

Van’t Hoff 分析和协同度

如果在不同温度下测量一个可观测物理量的值，对一个两态转变来说，就有可能确定PN和KN。通常，在蛋白质折叠/去折叠研究中所遇到的情况下，处于天然状态下的分子数量I0在低温下最大，而在高温下处于变性状态下的分子数量最大。随着温度的提高，处于变性态的分子数量呈S形曲线增加(图1)。天然状态和变性状态分子数量相同的温度称为转变(相变)温度(Tm)。这个温度下DGN＝0而KN＝1。相变时的热力学参数可以从KN随温度的变化得到：

lnKN＝(－DHN/RT)+ DSN/R               (13)

因此，由lnKN随1/T和(－DHN/R)的变化曲线的斜率，可以得到反应热焓的变化。方程(13)用来进行经典范得华分析，因此，这样得到的热焓称为范得华焓。由DSN＝DHN/Tm，可以求得Tm处的熵。

必须懂得：从范得华分析得到的热力学参数最终取决于计算得到的分子状态分布是否真实。如果该相变符合两态模型，则用方程(11)和(12)计算得到的分子状态分布符合真实分布，范得华热力学参数或“视在”参数是正确的。反之，则有关分布的计算和范得华热力学参数或“视在”参数也不正确的。问题在于：多数实验的情况下平衡状态的数量分布是未知的。蛋白质研究人员很早就认识到这种情况，他们的结论是：判断两态近似是否成立的最好方法是将从范得华分析得到的热焓变化与直接从量热仪测定的热焓变化进行比较。

量热仪测得的热焓是真实的转变热焓，因为它等于样品所释放或吸收的热量除以浓度。因此它是真实的状态函数，它仅与初始和终结状态的本质有关。而范得华热焓反映的是1摩尔“协同单位”转变时的热焓，这些协同单位的物理或结构内涵是系统的某个内在性质，与研究时采用的归一化无关。事实上它取决于系统内部协同作用的大小和范围。如果这些协同相互作用扩展到整个蛋白质分子，则范得华热焓和量热仪热焓相等；如果范得华热焓小于量热仪测得的热焓，则由系统界定的协同单位小于由研究者在计算热分析热焓时所定义的协同单位(通常为一摩尔蛋白质分子)。在这种情况下，相变只是通过部分折叠的中间体进行，因为内在协同单位小于蛋白质本身。反之，如果范得华热焓大于量热仪热焓，则意味着系统协同单位的扩展超出了单个分子的范围，存在着分子间的相互作用(通常是寡聚化)。因此，范得华热焓与量热仪热焓之比反映了系统内部的协同相互作用。

一般来说，范得华分析仅能正确地提供两态平衡的热力学参数。DSC一类的量热技术直接测量构象平衡的热力学参数，不附带任何模型假设，因此是直接获取系统能力学信息的唯一方法。此外，DSC也提供了一种研究相变热力学机制的途径。

差示扫描量热

DSC把量热仪样品池中的溶液的热容量作为温度的连续函数进行测量。为了确定蛋白质的热容量，需要蛋白质溶液和缓冲液扫描的数据。对于缓冲液(溶剂)的扫描，所量测的热容量可以写成

Cp,b＝                           (14)

这里mb是样品池中溶剂的质量， 是缓冲液的比热容。类似地，蛋白质溶液的热容可以写为：

Cp,p＝                           (15)

这里 是单位质量蛋白质的热容量，mp是量热池中蛋白质的质量， 是溶剂的质量。   可以由下式得到：

          (16)

这里，( )等于被蛋白质取代的溶剂的质量，可以用蛋白质的偏比体积表示，这样就可以得到：

         (17)

这里 和 分别为蛋白质和溶剂的偏比体积。偏摩尔比热容函数(Cp)可以简单地用 与蛋白质的分子重量的乘积来表示。Cp是DSC测量的主要量，是我们讨论的中心。

偏摩尔热容量

市售DSC仪器(例如MicroCal，Hart，Seiko，Perkin-Elmer)不具备精确测量稀蛋白质溶液的偏摩尔比热容量所需要的灵敏度和基线稳定性。因此，用这些仪器进行的大多数蛋白质量热分析工作限制在与热变性或其它热致相变相关的变态的相对测量上。这里比较突出的是基线的差减，它会引起大量的任意性。这些年中，设计了不同的基线差减方法，但是这些方法多数是仪器缺陷的产物，而不是分析在方法论方面的突破。从理论上说，分析与相变有关的热容量相关的热容量函数的唯一要求是已知参考状态(一般是天然状态)的热容量。如果一种DSC仪器可以准确且可重复地测量蛋白质样品的偏摩尔热容量，则基线差减的任意性可以消除。这种水平的灵敏度和稳定性只是到最近才能达到，它为数据分析的新方法敞开了大门。

热容量差额函数

如果一种蛋白质发生相变，其热容量函数将在某些特征温度下出现异常(一个或多个峰)。在这种条件下，热容量函数已经不可能再归结为单一的结构状态，因为它包含了相变时出现的所有状态的贡献以及相变温度区热焓波动的加剧的影响。这些因素引起了特征峰或与热致相变相关的峰。蛋白质热致去折叠的热力学分析中最重要的量是热容量差额函数(áDCpñ)，它等于量测得到的热容量函数减掉天然状态的热容量。

áDCpñ＝áCpñ－Cp,0                (18)

图2解释了由实验数据估算áDCpñ的步骤。如图2所示，如果天然状态的热容量已知，则即使在所采用的实验条件下天然状态从未被充分占据，也总是可以把天然状态的热容量从测量得到的热容量函数中减去。

热容量差额函数的统计热力学定义

在分析DSC数据时，需要从理论上采用统计热力学方法定义的最重要的量是平均差额热焓函数(áDHñ)，因为DCp等于DH在常压下对温度的导数。平均差额热焓增量函数是相变过程中出现的所有分子状态的热焓贡献

áDHñ ＝                         (19)

这里Pi表示第i种能态的分布数，或概率，DHi表示第i种能态的热焓与作为参照能态的天然能态的热焓之比。不同的相变模型中用不同的参数来表示Pi。热容量增量函数变为：

                                   (20a)

                                   (20b)

式右边相变热容量增量函数的第一项(áDCp,trñ)定义了热容量函数中的特征转变峰。式右边相变热容量增量函数的第一项(áDCp,blñ)定义了”S形”基线位移，这个位移通常是与蛋白质的去折叠或以DCp正变化为特征的其它相变相联系的。

       相变差额热容量测量的是与构象转变相关的热焓的变动。对式(20a)直接微分得到：

                                    (21a)

                                    (21b)

必须认识到：方程(21b)是热焓分布的二阶矩或离差。因此，在相变区观察到的峰是蛋白质经历不同热焓状态之间的相互转变时热焓变化加剧的直接反映。

信息内涵

       DSC提供三种信息：(1)绝对热容量；(2)总体热力学参数；(3)在相变中出现的能态被占据的概率和热力学参数即统计热力学信息。

绝对热容量

       如上所述，绝对热容量的测量只有有限的几个具备适当的实验设备的实验室才能进行。绝对热容量可以用来得到与结构相关的信息，以及多肽链的水化程度，或在溶剂中的暴露程度。这个信息非常重要，可以用来估计热变性引起的去折叠的程度。已经证明：从高分辨率的结构参数可以精确预测不同蛋白质构象的绝对热容量。这些发现使得有可能发展解决蛋白质折叠能力学问题的新方法，还可以发展更精确的基于结构的分子设计方法。

总体热力学参数

       与蛋白质热变性相关的最重要的总体热力学参数是去折叠态与天然态之间的自由能、热焓、熵和热容量的变化量(DG)、(DH)、(DS)和(DCp)。 所有这些参数都是状态函数，即所有这些值只与变性态或天然态的本质有关，而与特定的转变途径或部分折叠中间态的存在无关。从实际的观点来看，这些参数与所测得的热容量函数的形状无关，可以用一种与模型无关的方式来确定。

       热容量变化是热变性态与天然态热容量的差。热焓变化是相变热容量差额函数(áDCp,trñ)下的面积

DH=                             (22)

这里的积分限为相变的起始和终止温度，所有分子基本上都处于初始态或最终态的温度。熵的变化量可以用下式来估计

DS＝                              (23)

DH和DS都是指的相变温度Tm下的值，即DH＝DH(Tm)，DS=DS(Tm)。必须注意：方程(22)和(23)都是根据相变差额热容量曲线定义的，这就意味着必须把áDCp,blñ从热容量差额函数中减去。多年来，采用了不同的差减方法。过去，áDCp,blñ通常用一个阶跃函数来近似，阶跃函数限定于中心位于Tm的垂线与热容量函数外推的起始值和终值的交点之间。由于基线与去折叠的程度成比例，因此可以得到一种更准确的估算方法，即用热容量函数的normalized积分来定义其形状。这种替代方法用计算机数字数据比较容易实现，对于两态相变，数学上是精确的。一般来说，总体热力学参数DH和DS对用什么方法来差减不太敏感。但是，对于热容量函数的形状的统计热力学分析，情况又有所不同。

热容量函数的统计热力学分析

       总体热力学参数是状态函数，因此它们只取决于热容量函数的面积，而与其形状无关。另一方面，热容量函数的形状定义为热相变的途径或轨迹。因此从对于热容量函数形状的分析可以对相变过程中各能态的分布概率进行估价。

       上面已经指出，热焓差额函数在DSC数据的统计热力学分析中起核心作用，它给出了实验与折叠/去折叠分配函数之间的直接联系。

从DSC数据可以直接得到áDHñ，因为它是áCpñ的积分。

áDHñ＝                          (24)

这里T0是蛋白质处于天然态时的某个温度。

从方程(4)也可以得到áDHñ与分配函数之间的关系：

áDHñ＝RT2（¶lnQ/¶T）

Freire和Biltonen首先理解了这一点，把方程(4)重新写成积分的形式，从DSC可以直接得到折叠/去折叠分配函数：

lnQ＝                             (25a)

                                   (25b)

方程(25a)和(25b)为热容量增量函数的去卷积理论奠定了严格的基础，因为它们建立了实验数据和统计热力学的最基本的函数之间的数学联系。热焓函数作为一个物理可观测量的唯一性可以通过把它和其它技术测量的其它可观测量进行比较来解释。而相对于天然态的热焓增量áDHñ这样的可观测量的情况则有所不同，它是温度反转(inverse temperature)的的共轭变量。此时，平均热焓也是由方程(9)给出：

áDHñ＝                            (26)

主要的不同点是，与任何可观测量不同，DHi也在方程(26)的指数项内发生。DSC的这个唯一的性质造成了分析上的极大差别，使得开发旨在获得折叠、去折叠转变的完全热力学表征的严格去卷积算法成为可能。对于其它物理可观测量来说，αi的值数学上与Pi值并不相关，也就是说，熔融曲线的幅度与热力学函数无关，实验数据不能用于获取相变的完全热力学描述。

对于热容量函数进行去卷积分析的主要目的是确定热致去折叠时被占据的那些能态的数量以及其中每一个状态的热力学参数。经过若干年时间，去卷积算法得到逐步完善。现在，最有效的去卷积算法中包括一种递归算法，这个算法包括多重循环，某个独立的循环都有一个非线性最小平方寻优的步骤，最后终止于一个全局非线性最小平方优化计算。应用这些方法分析了分子伴侣DnaK, α－乳白蛋白，葡萄状球菌核酸酶等的多态相变。

对实验确定的蛋白质热容量的分析

对蛋白质热容量的不同贡献

蛋白质的热容量起源于相应于内部振动、受阻转动及与溶剂的相互作用的热焓波动。整个相变区域有一个与方程(21)描述的相变相连的增强的热焓波动给出的附加的贡献。蛋白质水溶液中摩尔偏热容可以认为是由一个内在项和水化项组成。内在项包括来自共价键和非共价相互作用的贡献。这样,蛋白质的热容量可以写成:

                             (27)

第一项Cp,a 称为primary热容量,它包含了原子键和共价键的贡献.按照定义,这一项只取决于蛋白质的氨基酸组成,与蛋白质的构象状态无关.对于大量有机分子的实验研究表明:这些化合物的热容量在键或基团的水平上大部分是可加的。第二项Cp,b包含了蛋白质内所有非共价相互作用。第三项Cp,c包含了蛋白质与溶剂的相互作用即水化的贡献。Cp,b和Cp,c分别取决于蛋白质的物理状态、二级结构的组成含量和与溶剂的相互作用。

       与折叠、去折叠或构象变化相关的热容量变化仅涉及Cp,b和Cp,c，因为这些蛋白质的转变不涉及质量或一级结构的变化

               (28)

蛋白质的原初热容量

       在生物学感兴趣的温度范围内(0~100°C)，蛋白质的原初热容量主要包括了每个价键的伸缩和弯折模式的振动频率及内部转动的贡献。在这个温度范围内，电子能级的贡献可以忽略不计。蛋白质的原初热容量可以从氨基酸单独的贡献、肽键的贡献及原子或键的可加性参数比较精确的计算出来。脱水状态下全部20种氨基酸的热容量已经测量得到。此外，单独的原子和化学键的贡献也通过分析一些小的有机化合物的热容量得到。表1和图4总结了25°C下计算得到的10种球蛋白的原初热容量。

       由单独的氨基酸的贡献计算得到的原初热容量接近测量得到的脱水蛋白质的热容量，这和蛋白质绝对热容量来源于共价键结构的想法是一致的。但是必须注意：由脱水天然蛋白质测量得到得的热容量的实验值一般比计算得到的原初热容量稍大一些，提示非共价相互作用也确实对热容量稍有贡献。对于脱水状态的蛋白质热容量测量的结果，其平均值为0.298±0.003 cal/k×g，而由氨基酸的热容量之和计算得到的平均原初热容量为0.283±0.006 cal/k×g。一般来说，按重量来计算，一级结构对脱水蛋白质热容量的贡献是类似的，大约占整个热容量的97％。

非共价相互作用对蛋白质热容量的贡献

       如表1和图4所示，由氨基酸计算得到的热容量与脱水天然蛋白质的测量值相差很小，提示非共价相互作用的贡献也很小。如果把脱水热容量和原初热容量的差作为非共价结构贡献大小的标志，则非共价相互作用对热容量的贡献大约为0.007 cal/k×g。预计非共价相互作用是蛋白质内堆积密度的函数，可以用埋藏在蛋白质内部的总面积来表示。

溶液中天然蛋白质的热容量

表1和图4中的蛋白质之所以被选择来进行计算，是因为它们在溶液中的热容量已经用量热方法得到。天然蛋白质的热容量大于脱水蛋白质的热容量，表明了水化对热容量的贡献。25°C时水化对热容量的贡献大约是0.06 cal/k×g，大约为天然状态下总热容量的15％。但是水化对不同蛋白质的相对贡献是不同的，提示蛋白质表面上的成分引起了热容量的增加。同样需要指出的是：25 °C下溶液中天然蛋白质的热容量的温度依赖性也比脱水蛋白质大。

       溶液中热容量的增加是由于蛋白质表面的原子与溶剂的相互作用。天然蛋白质暴露在溶剂中的表面包括了极性和非极性区域，其比例是不同的。平均来看，天然状态下55％的溶剂可及表面为非极性的，这定量地证明了水化对于热容量的贡献是正的。一般来说，蛋白质的水化热容量与非极性和极性溶剂可及表面的面积大小成正比，这与热容量随构象变化的情况是一致的。

       溶液中天然状态蛋白质的热容量在可量测的温度范围内(大约0~50°C)是温度的线性函数，其时间依赖性平均为1.62´10-3 cal/k2×g。但不同蛋白质差异明显，反映了暴露于溶剂的表面的组成不是均一的。

去折叠状态的热容量

       25°C时去折叠状态的热容量比天然状态要大。平均来说，去折叠状态比天然态的热容量大0.12cal/k×mol，反映了天然状态下埋藏在内部不接触溶剂的极性和非极性残基的比例在去折叠态中暴露于溶剂后是不同的。虽然天然态的热容量与温度成线性关系，但去折叠态与温度的关系是非线性的。在0~100°C范围内去折叠状态的热容量与温度的关系可以用二阶多项式很好地近似

Cp=Cp(25)+a(T-25)+b(T-25)2        (29)

       一般来说，天然态和去折叠态热容量大小及温度依赖性的不同主要反映了这些蛋白质构象下暴露于溶剂的极性和非极性表面比例的差别，此外也在一定程度是反映了折叠态内部非共价相互作用较小。下面将介绍：用一个数学函数就可以表示不同蛋白质构象的热容量的大小及其温度依赖性。

可质子化基团的热容量贡献

除了辅助因子、金属离子的存在等特殊影响以外，质子化效应可能是仅有的一个对蛋白质热容量有可量测到的贡献的一般性效应。具有可离子化基团的侧链如组氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸对于热容量的贡献是不同的。这取决于它们是否能质子化。质子基团对热容量的贡献Cp,p可表示如下：

Cp,p=       (30)

其中， 是该基团的质子化热容量，Fp是质子化的程度，DHp是有效质子化焓。第一项与质子化的程度成正比，第二项产生于质子化程度随温度的波动。一般来说，与整个热容量相比，质子化的贡献是较小的。例如，质子化的咪唑基比未质子化的咪唑基的热容量大4cal/k×mol，质子化的羧基的热容量比未质子化的羧基大30cal/k×mol。当Fp=0.5时，也就是pH值等于可质子化基团的pKa时，方程(30)中第二项的贡献得到最大值，例如，对于pH值等于pKa的非缓冲液中溶解的组氨酸，由于热波动引起的最大的对热容量的贡献约为70cal/k·mol，因为在此条件下ΔHp=-7kcal/mol