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可能出现的二级结构按照稳定性大小自动排序最稳定的一种排在最前使用卷动条可以
看到未显示的部分
除了上述功能这一板块还具有激活以下功能的快捷按钮Search Criteria 搜索参数
窗口Search Results 搜索结果如果已经实施过搜索窗口以及Edit Primer 引物编辑
窗口点击按钮可以使相应部分伴随引物对以图形显示
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Edit Primer 引物编辑窗口
Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列
在windows系统或Power Mac的Command-X Command-C 及Command-V系统中您可以
使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列并从
剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活用以
将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑
发生变化Analyze 按钮就可以使用点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物
您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基如果您修改氨基酸残基相应位置可能出现多
义密码子
除了上述的引物性状和二级结构资料具体参阅PRIMER PREMIER窗口的章节该窗
口也提供了限制性酶分析功能您可以通过点击Enzyme 按钮通过手动或软件提供的筛
选方案来选择一组限制性酶
您可以使用Prime 按钮来将引物移动到更合适的结合位点通常这项功能可以让您确
认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在
其他信息如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表请关闭本窗口从主菜单上选
择Function >GeneTank激活GeneTank窗口再选择Translate > Change Parameters打开
Select Codon Table窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口
可选操作
Function > Edit Primer
Search Criteria 搜索标准窗口
以下是基本搜索标准的详细信息
根据PCR引物测序引物或杂交探针的不同要求选择不同的搜索标准是很有必要的
PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的标准某些用以优化引物扩增能力的
标准不一定也适合测序引物或杂交探针的设计这两者需要的是较高的退火温度因此当您选
择不同的搜索标准PRIMER PREMIER将对相关标准作出调整以适应不同的要求搜索公式
中使用的具体参数请参看后面的Automatic Search Parameter 自动搜索参数章节
Search Type 搜索类型框将指定您要搜索的是单个引物两条单独引物引物对或为
当前引物找寻合适的反向引物
默认设置下Search Range 搜索范围是当前序列的全长默认PCR产物长度为100 bp
到500 bp 如果您是搜索单个引物该数值将不会起作用您也可以为搜索设定Primer Length
引物长度您将会在下一章节了解该项设定的具体作用
最后您可以设定Search Mode 搜索模式为自动或手动除非您有很特殊的要求或想完
全控制特定的搜索参数建议您使用自动搜索利用PRIMER PREMIER找到多条引物再从
中通过详细分析来挑选合适的使用
可选操作
Function > Search
Search Parameter Windows 搜索参数窗口
搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索
当您希望搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配您可以在激活False Priming
选项后利用Files 按钮选择这些序列文件
Automatic Search 自动搜索
尽管PRIMER PREMIER已经自动设置了一些数值您还是可以选择在自动搜索中需要使
用哪些参数点击去掉相应参数左边框中的则该参数在搜索中不会被考虑
自动搜索开始的标准很严格但如果没有找到合适的引物则标准会自动降低直到找到合
适的引物下列图表中显示了在PCR引物设计中自动搜索初始的严格参数其中Tm值范围是
根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的



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Manual Search 手动搜索及引物设计原理
在过去十年中为获得高效扩增PCR方法得到的很大发展我们对引物稳定性二级结
构和适宜长度的了解使得我们在保证引物特异性的前体下大大提高了引物的扩增效率而
PRIMER PREMIER 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡
引物长度
引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度对越多数实验适宜引物长
度为18到24个碱基等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建
library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样
本的克隆能起到重要作用长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物也允许您通过降低
退火温度来能提高反应的灵敏度不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互
补等二级结构
理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡
PRIMER PREMIER 已经包含了合适的引物长度范围如果您改变了它们软件将会自
动记录并在下次使用直到您再次改变它们因此您最好根据不同实验的特殊要求输入合适
的长度范围
PRIMER PREMIER 以最短的指定长度开始搜索引物如果找到的引物的Tm值小于设定
范围或GC含量不符合要求它将给引物增加一个碱基长度并重新计算Tm值和GC含量看其是否
符合要求如果引物长度达到最大值还不能符合要求则该引物将会被剔除这种搜索机制保
证找到的引物是符合Tm值和GC含量要求的最短引物
为设计一条高效引物有几个参数必须考虑PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次
如下
Tm 融链温度
PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链
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温度请参看附录A中关于公式的说明选择的Tm范围应该为退火提供足够的热度在自动搜
索中PRIMER PREMIER使用的范围选择机制如下
首先计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm值得出平均值后按照不同的严格度
要求确定的波动值根据这一平均值来计算出Tm范围
根据已发表的实验数据文献8 PCR反应的合适Tm范围为56到63°C 以上机制是被设
计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物
GC% GC含量
对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC
含量至少应为50% 请参看上文Automatic Search章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具
体参数
Degeneracy 多义性
当设计多义引物时应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3
末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸详情请参看本说明的
Degeneracy 多义性章节
3’ End Stability 3 末端稳定性
引物稳定性影响它的错配效率一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对
稳定性较弱的3 末端如果引物3 稳定性强有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错
配形成非特异性扩增条带secondary bands 而3 末端稳定性低的引物较好的原因是
在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸
GC Clamp GC钳
引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端这一段有较强稳定性的5 末端称为GC
钳它保证引物与模板的稳定结合选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的
前提下尽量降低退火温度使用菜单Report > Internal Stability选项可以看到象下图所显示的
一个引物的内部稳定性曲线表

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请注意上图就显示一个好的引物3 末端稳定性较弱而5 末端有一个较强的GC钳
Repeats and Runs 重复和循环
PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物例如引物包含
ATATAT这样AT被重复三次那么这个引物将被剔除您可以设定可以接收的碱基重复的数量
Secondary Structures 二级结构
二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正
确结合的引物数量发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率形
成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用
Hairpin 发卡结构
发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构并
由于发卡结构的形成是分子内的反应仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成发卡结构的稳
定性可以用自由能衡量自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需
要的能量如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则
该结构可以干扰反应按下按钮All 可以使用PRIMER PREMIER软件中的Hairpin Report
功能帮助您回避类似二级结构
Dimer 二聚体
引物之间的配对区域能形成引物二聚体它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结
构它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向
引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚
体扩增使用Dimer Report功能可以预测二聚体的形成
False Priming 错配
如果引物可以结合除目的位点外的其他区域扩增效率将明显降低目的产物带将减少或
出现涂布smear PRIMER PREMIER会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成
局部的错配3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基
配对您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量
Pair Rating 匹配度评分
匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特
异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始PRIMER PREMIER会计算
每一对引物的匹配度100分为满分并按照分数按降序排列计算引物对匹配度以及单个引
物评分的公式请参看本说明的附录
Search Results 搜索结果
当您点击搜索程序窗口的OK 按钮接受搜索结果后Search Results 搜索结果窗
口将会打开它显示了搜索中找到的所有引物或引物对如果您选择了一条引物或一对引物对
在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果与当前的序列配对的引物的位置和
序列也会在Direct Select框上显示
可选操作
Function > Search Results
其他信息Search Results窗口的位置和大小是可以调节的这样在其他窗口里您感兴趣的显示
内容如引物分析结果就不会被遮住了
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Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR反应引物窗口
巢式PCR反应通常能大幅提高灵敏度同时又减少非特异性扩增产物通常在模板DNA浓
度太低或不纯时采用您可以使用自动搜索或按您实验的需要搜索然后从中选择一系列合乎
要求的引物PRIMER PREMIER可以确认它们是否会形成二聚体来帮助您选择巢式PCR反应
引物
当您接受搜索结果选择菜单Function >Multiplex/Nested Primers选项即可打开该窗口
所有引物与全序列以图形显示在窗口顶部序列上的框架代表窗口中间放大显示的部分序列所
在的位置通过拖动横行滚动条可以改变放大显示的区域所有提供的引物以竖线形式在顶部
的图框显示以蓝色三角形或红色三角形在下面的放大框中显示蓝色代表正向引物红色代
表反向引物
点击三角形即选定一条对应的引物应用于您的巢式PCR反应同时三角形由空心变为实心
表明已被选中选中的引物会在下面的图框中以图表形式显示您会看到在您选择引物的同
时已选引物间可能存在的交叉二聚体也同时显示出来PRIMER PREMIER能即时分析所有
的已选引物并显示它们之间间可能存在的交叉二聚体结构您可以继续选择引物直到您找到一
组没有或很少有稳定的交叉二聚体的引物要剔除一条已选引物非常简单再次点击对应的实
心三角形就可以了您也可以手动添加一条引物这样便于您使用已有的引物或通用引物您
也可以手动添加所有的引物并分析它们之间的能否形成交叉二聚体您可以指定输入的寡聚
核酸作为正向引物还是反向引物它们的起始位置和序列如果不指定起始位置则默认为5
末端第一个碱基如果想删除一条引物只需选定并点击Delete 按钮
您可以打印模板序列及所有的引物已选引物显示为实心三角形未选引物显示为空心三角形
列表包含的引物以及所有可能的交叉二聚体结构也同样被打印出来
Database 引物数据库窗口
引物数据库可以用来保存引物序列您可以为每一条引物命名并保存在一个原有的或新
建的数据库中在数据库窗口中您可以使用Order Primers按钮来定购引物有两种主要方
法可以将已选的引物输入到数据库中您可以在Search Results窗口中标记想选择的引物然

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后在引物数据库窗口中使用Get Marked Primers按钮将标记的引物全部输入到数据库另一种
方法是您直接选择一条或一对引物再利用Current Primer Pair 当前引物对图框将其输入
数据库引物数据库可以保存引物的起始位置序列对应链和引物名称选择一条引物使
用菜单的编辑选项或点击本窗口的快捷按钮可以编辑引物的起始位置序列对应链即方向
和引物名称
从下拉菜单里选择一个引物数据库您可以使用Import 按钮输入以往保存的引物并在
当前序列上进行分析在引物被选择后您可以使用PRIMER PREMIER窗口对其进行编辑和
分析您可以使用Edit Primer窗口上的prime 按钮在当前上序列寻找最佳的结合位点
您可以添加一个新的数据库并命名区分这样便于您依照不同的项目或模板序列将保存引
物信息您也可以同样便利的删除一个数据库
使用Add Primer 按钮可以添加一条新引物同时激活一个窗口用来填写引物名称起
始位点对应链和引物序列如果不指定起始位置则默认为5 末端第一个碱基
Reports 分析报告
使用Reports菜单可以提供多种分析报告除了在PRIMER PREMIER窗口下也可以直接
打开的二级结构报告也可以提供当前引物的内部稳定性图表和比吸光度报告选择Reports
菜单下的Optical Activity选项能打开一个报告窗口显示当前引物对的分子量和比吸光度
activity 单位nmoles/OD和ug/OD
当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针将会显示一条贴近最近的序列的分界线而数据
输出窗口也会即时更新而相应五聚体会高亮显示该图表窗口可以调整大小以便看清细节
当您选择Reports菜单下的Hybridization Time 杂交时间选项您可以输入引物的长度和
浓度点击Analyze 按钮可以得到杂交时间
Synthesis Order Form 合成订单
在搜索及分析完引物后如果您决定定购合成该引物您可以使用软件生成订单为方便
您使用软件已经有一个现成的模板您可以创建一个新订单并输入您的地址和其他信息
并命名保存您可以使用这个订单作为今后的订单模板Database window 数据库窗口可
以用来选择您想合成的引物只需选择您想合成引物点击Order Primer 的快捷按钮PRIMER
PREMIER 将在合适的位置自动添加您选择的引物并附上地址及其他信息生成一张订单您
可以加上您的注释并将其打印送出您可以保存该订单便于以后查看
Optical Activity 比吸光度
引物对于260nm波长紫外光的吸光度即A260与其浓度成正比1mg/mL的DNA吸光度为
0.02 软件也能计算引物的分子量以便计算如何稀释新合成的引物
Molecular Weight 分子量正反引物分子量均以grams/mol 克/摩尔为单位这是根据
分子量列表计算得出的
nmol/A260 在260nm波长紫外光下每单位吸光度代表的引物的纳摩尔数量这是根据吸光
系数和分子量列表计算得来的
ug/A260 在260nm波长紫外光下每单位吸光度代表的引物的微克数量这是根据吸光系数
列表计算得来的
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Degeneracy 多义性
某些PCR实验需要引物结合到不确定的序列例如下列情况
知道表达蛋白的序列但是不知道DNA序列
模板DNA测序结果不准确或不完全
利用其他生物体已确认的序列来扩增某一编码区
利用模板的同源序列设计引物
在设计多义引物时除了在上述搜索参数章节提及的一般参数外也要考虑引物的多义性
多义性尽可能低的引物有更高的特异性因而更为理想尽量避免3 末端的多义性也很关键
因为3 末端即使一个错配也会抑制延伸PRIMER PREMIER 能自动搜索模板序列设计出
在3 末端多义碱基比例和数量都较少的引物参见文献13
有报道说PCR程序能显著改变多义引物扩增的成功率该种优化程序开始的2 5个循环
采用不严格的退火温度然后的25到40个循环使用更为严格退火温度宽松的退火条件可以
允许部分配对的引物与模板结合在两个循环后扩增产物的5 末端就与引物一致并能很
好的作为以后扩增的模板了此时提高退火温度能得到更高的特异性
Graphs 图表
通过Graph菜单可以获得整个序列Tm 融链温度GC% GC含量和Internal stability
内部稳定性的图表Tm是所有可能的引物的融链温度引物长度是由Preferences 默认
参数设定的GC%则是所有可能引物的GC含量Internal stability 内部稳定性则是在每
一序列位点起始的五聚体的稳定性自由能当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针将会显示
一条贴近最近的序列的分界线而数据输出窗口也会即时更新而相应五聚体会高亮显示
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   Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析
PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶的分析功能包含约900种酶同时也提供工
具让你您方便的添加其他酶通过从默认群组中选择或剔除限制性内切酶您可以创建一个新
的群组使用此外您可以根据限制性内切酶特性使用特征筛选来创建新的群组并作为当前群
组来进行限制性内切酶分析限制性内切酶分析可以采用以下几种格式显示列表图谱或序
列
这一功能板块有下列几个部分
Restriction Enzyme Analysis Window 限制性内切酶分析窗口
Filter Window 特征筛选窗口
Edit Window 编辑窗口
Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析窗口
PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶分析功能包含约900种酶您可以启用群组
编辑从All Enzymes 全部酶中添加或删除一些酶作为当前使用的群组Selected
Enzymes 框显示了当前使用的群组包含的酶它是全部酶的子集被用来做限制性内切酶的
分析有两种方法可以用来选择当前群组
1 从All Enzymes 框中选择您想添加的酶添加到当前群组中对于windows或Power
Mac系统而言在点击同时按住CTRL键即可选择多个酶按住SHIFT键同时点击可以选择
两次点击之间范围内的所有酶使用Add 按钮将选中的酶加入到当前群组在Selected
Enzymes 框中选择酶并点击Delete 按钮可以从当前群组中剔除特定酶同样在All
Enzymes 框中双击某个酶即为添加在Selected Enzymes 框中双击某个酶即为剔除
2 使用特征筛选窗口根据某些特征来选择当前群组具体请看下面的Filter window 特
征筛选窗口的章节
Restriction Sites 酶切位点窗口
在Restriction Enzyme Analysis窗口点击OK 按钮可以打开Restriction Sites窗口可
选显示方法有
Table 列表以表格形式列出酶识别序列和切割位点以及在待分析序列上的切割位
置
Sequence 序列显示所有酶在分析序列上的实际切割位点
Map 图谱以长条形式显示序列在其中使用竖线表示所有的酶切位点
Non-cutters 无切点酶列出所有在序列上没有切点或不符合预设参数的酶
您通过指定切点数量限制来有选择的显示酶切分析结果例如您点选4 数字框切
点多于或等于5个的酶将不会被显示
使用菜单的File >;Print 您可以打印以Table Sequence 或Non-cutters 形式的分析结果
Edit Enzyme 限制内切酶编辑窗口
想要在All Enzymes群组中修改某一种酶选择该酶并点击Edit 按钮可以激活Edit
Enzyme 限制性内切酶编辑窗口在这里酶的名称识别位点和热稳定性都可以修改
注意如果某个酶的切点多于50个将只显示前50个其余的则被忽略
点击Add 按钮可以激活新内切酶窗口其名称和识别位点采用默认设置点击Delete
按钮则可删除选定的酶点击OK 按钮则保存所有修改并返回Restriction Enzyme Analysis
Window 限制性内切酶分析窗口
注意您无需每次修改都点击OK 按钮软件能记住您这一次的所有修改点击OK 按钮
可以保存所有修改而点击Cancel 按钮则放弃所有修改
Filter 特征筛选窗口
您可以使用特征筛选窗口根据酶的特征来选择当前群组进行分析

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当您点击OK 按钮后Selected Enzymes框内包含的内切酶列表将成为酶切分析使用
的当前群组并将使用该群组进行限制性内切酶分析
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   Motif Analysis 基序分析
软件为您提供了包括约165种常用基序的分析功能同时也提供工具让你您方便的添加其
他基序通过从默认群组中选择或剔除基序您可以创建一个新的群组使用并作为当前群组
来进行基序分析基序分析可以采用以下几种格式显示列表图谱或序列
这一功能板块有下列两个部分
Motif Analysis Window 基序分析窗口
Edit Window 编辑窗口
Motif Analysis 基序分析窗口
PRIMER PREMIER 为您提供的基序分析功能包含约165种基序您可以启用群组编辑从
All Motif 全部基序中添加或删除一些基序作为当前使用的群组Selected Motif 框显
示了当前使用的群组包含的基序它是全部基序的子集被用来做基序分析可以用下述方法
来选择当前群组
从All Motif 框中选择您想添加的基序添加到当前群组中对于windows或Power Mac
系统而言在点击同时按住CTRL键即可选择多个基序按住SHIFT键同时点击可以选择两
次点击之间范围内的所有基序使用Add 按钮将选中的基序加入到当前群组在Selected
Motif 框中选择基序并点击Delete 按钮可以从当前群组中剔除特定基序同样在All Motif
框中双击某个基序即为添加在Selected Motif 框中双击某个基序即为剔除
Motif Sites 基序位点窗口
在Motif Analysis窗口点击OK 按钮可以打开Motif Sites窗口可选显示方法有
Table 列表以表格形式列出基序基序序列和数量以及在分析序列上的位置
Sequence 序列显示所有基序在分析序列上的位置
Map 图谱以长条形式显示序列在其中使用竖线表示所有的基序的位点
Motifs Absent 不存在的基序列出所有在序列上没有或不符合预设参数的基序
您通过指定基序数量限制来有选择的显示基序分析结果例如您点选4 数字框出
现多于或等于5次的基序将不会被显示
使用菜单的File >;Print 您可以打印以Table Sequence 或Motif Absent 形式的分析结果
Edit Motif 基序编辑窗口
想要在All Motif群组中修改某一种基序选择该基序并点击Edit 按钮可以激活Edit Motif
基序编辑窗口在这里基序的名称识别位点和基序说明都可以修改点击Add 按
钮可以激活新基序窗口其名称和识别位点采用默认设置点击Delete 按钮则可删除选定
的基序点击OK 按钮则保存所有修改并返回Motif Analysis Window 基序分析窗口
注意如果某个基序出现多于50次将只显示前50个其余的则被忽略
注意您无需每次修改都点击OK 按钮软件能记住您这一次的所有修改点击OK 按钮
可以保存所有修改而点击Cancel 按钮则放弃所有修改
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Menu Commands 菜单命令
以下功能板块都有自己的主菜单
GeneTank 主菜单
Primer Premier 主菜单
Enzyme Results 主菜单
Motif Results 主菜单
GeneTank 主菜单
File
New Sequence 重新打开一个序列空白的GeneTank 窗口
Open Sequence 提示您使用一个文件来打开已有序列
Save 将当前序列保存为一个文件无需经过Import Sequence 窗口确认序列起始位置
您就可以打开一个这样保存的文件
Save As 将当前序列另存为指定文件
Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义
Print 使用不同格式及组合进行打印
Quit 退出PRIMER PREMIER
最近打开的四个文件列表
Edit
通常的剪切cut 复制copy 和粘贴paste 选项
Preferences 让您选择软件种使用的各种参数某些版本该选项在File主菜单下
View
Show Header 显示在GeneTank窗口打开的当前序列的文件题头
Sense Strand 显示当前序列的正链
Anti-sense Strand 显示当前序列的负链
ds DNA 显示当前序列的双链
Grouping 选择3个碱基一组或10个碱基一组的显示方式
5’ Seq no 指定序列5 端起始位置并重新排序某些版本没有该选项但在窗口上有快
捷按钮
Search 注意某些版本没有该主菜单相应选项在Edit主菜单下
Find 从当前位置开始在序列中查找特定序列段
Find Next 在序列中查找特定序列段的下一个出现位置
Go To Position 将指针移动到序列的指定位置
Function
Primer Design 选择该功能即根据预设参数开始设计引物
Restriction Enzymes 即根据预设参数进行限制性内切酶分析
Motifs 即根据预设参数进行基序分析
Bias majority by 当某一碱基不保守时倾向以哪一序列为准
Speaker 语音校读
这一主菜单下的选项除了当前使用的功能外都可选
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Translate
To DNA 从当前蛋白序列反推DNA序列
To Protein 将当前DNA序列翻译为蛋白序列
Change Parameters 改变翻译的阅读框或密码子列表
Edit Codon Table 添加删除或修改密码子列表
Window
这一主菜单列出除当前窗口外已打开的所有窗口选择其中一个将切换到对应窗口
Help
使用这一菜单查阅帮助文件帮助文件中的信息与本说明大致一样帮助以屏幕格式显示
并包含超链接便于您快速转至相关主题也可以使用搜索功能寻找主题
Primer 主菜单
File
Preferences 让您选择软件种使用的各种参数
Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义
Print 使用不同格式及组合进行打印
Quit 退出PRIMER PREMIER
Edit
Find 在序列中查找特定序列段
Find Next 在序列中查找特定序列段的下一个出现位置
Function
Search 打开Search Criteria window 搜索参数窗口设定参数并开始搜索引物
Search Results 如果已实施搜索该选项将激活Search Results window 搜索结果窗
口
Edit Primer 您可以添加删除和修改引物序列并进行即时分析也可以将引物移动到下
一个最适合的错配位点
Multiplex/Nested 从搜索结果中选择相匹配的一组复式或巢式PCR引物也可以添加或
删除新引物并放在已选择引物群组中分析
Database 添加删除或修改引物数据库修改其中的引物的名称对应链序列及起始
位点也可以生成引物合成订单
在以上菜单的分界线以下还列出了另外三个功能板块
Report
Hairpin 显示所选的正向或反向引物的所有发卡结构
Dimer 显示所选的正向或反向引物的引物所有二聚体结构
False Priming 显示所选的正向或反向引物的所有错配位点
Internal Stability 绘出所选的正向或反向引物的内部稳定性图表
Optical Activity 显示引物的分子量及比吸光度
Hybridization Time 针对特定长度和浓度的引物计算杂交时间
Graph
Melting Temp Tm 绘出全序列的引物Tm 图表
GC % 绘出全序列的引物GC含量图表
Internal Stability 绘出五聚体的稳定性图表单位Kcal/mol
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Window
参看Gene Tank相关说明
Help
参看Gene Tank相关说明
Enzyme Results 主菜单
File
Preferences 让您选择软件种使用的各种参数
Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义
Print 使用不同格式及组合进行打印
Quit 退出PRIMER PREMIER
Function
Primer Design 选择该功能即根据预设参数开始设计引物
Restriction Enzymes 即根据预设参数进行限制性内切酶分析
GeneTank 显示GeneTank 窗口
Motifs 即根据预设参数进行基序分析
Window
参看Gene Tank相关说明
Help
参看Gene Tank相关说明
Motif 主菜单
File
Preferences 让您选择软件种使用的各种参数
Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义
Print 使用不同格式及组合进行打印
Quit 退出PRIMER PREMIER
Function
Primer Design 选择该功能即根据预设参数开始设计引物
GeneTank 显示GeneTank 窗口
Restriction Enzymes 即根据预设参数进行限制性内切酶分析
Motifs 即根据预设参数进行基序分析
Window
参看Gene Tank相关说明
Help
参看Gene Tank相关说明
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附录
附录A 公式法则
附录B 多义碱基表
附录C 氨基酸缩写符号
附录D 软件上限
附录E 参考文献
附录F 系统要求
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附录A 公式法则
引物融链温度Tm计算公式
融链温度的计算基于相邻二碱基对热力学理论nearest neighbor thermodynamic
theory 计算公式出自与Freier 等发表的文章文献7 这些是高度精确的相邻二碱基对Tm 计
算法则为得到尽可能准确的计算结果对公式进行了部分修正
Tm = H/ S + R ln C/4 + 16.6 log [K+]/ 1 + 0.7 [K+] - 273.15
H 是螺旋结构的焓值
S 是螺旋结构的熵值
C 是DNA浓度
[K+] 是盐浓度
每一条寡聚核苷酸的H 和S 根据Breslauer K.J.提出的理论文献2 计算由于
Breslauer K.J.使用的热力学计算方法是在1M的Na+条件下所以有必要加入一个参数[K+]来
根据盐浓度修正公式[K+]的计算要同时考虑反应体系中的单价离子和游离Mg2+ [K+]数值由
以下公式计算Sprt即取平方根
[K+] 单价离子浓度4 Sqrt 游离Mg2+离子浓度1000
盐浓度即[K+] 在参数设定preferences 中也称为Na+ 当量会根据单价离子和游离Mg2+
浓度而自动更新默认单价离子和游离Mg2+T浓度分别为50.0 mM 和1.5 mM 这样总盐浓度
等于204.9 mM
在文献7 Freier et al. 提供的计算公式中C值是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的
总浓度它即不是引物浓度也不是起始模板浓度而是PCR产物的浓度由于在PCR过程模
板的浓度变化很大很难确定C的具体数值根据文献11的建议Rychlik, W. et al. 一般经
验公式在普通PCR反应和测序反应中将其当作250 pM 通过File菜单下的选项您可以打开
Preferences窗口来修改这项预设值
产物融链温度Tm的计算公式
由于相邻二碱基对nearest neighbor 模型只适用于例如引物的寡聚核苷酸PCR产物
的融链温度不能使用该模型提供的公式来计算计算较长的双链DNA 可以使用Wetmur J.G.
文献12 的公式
产物Tm=81.5 + 16.6 log [K+]/ 1+0.7[K+] + 0.41 %G + %C - 500/length
盐浓度即[K+] 在参数设定preferences 中也称为Na+ 当量也是由上述公式得来产
物的GC% 和长度也要考虑在内
最适宜退火温度计算公式Ta Opt
PRIMER PREMIER 使用Rychlik的公式文献11 自动预测引物对的优化退火温度在
PCR反应的退火步骤使用该优化退火温度能提高目的产物产量并减少错误的产物
Ta Opt = 0.3 引物Tm + 0.7 产物Tm – 25
在公式里的引物Tm是相对不稳定的引物产物对的融链温度产物Tm则是PCR产物的融
链温度计算方法参看上述相关章节
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自由能G计算公式
焓值和熵值的计算是基于Breslauer等文献11 建立的热力学参数集其中包含共10种
Watson-Crick DNA的相邻二碱基对作用nearest-neighbor interactions 模式根据这种方
法一段寡聚核苷酸的自由能可由其中每一双核苷酸的焓值和熵值以及预设参数中指定的温度计
算出来该预设温度可以在Preferences窗口根据实际的环境温度进行修改该实验特指在1M
NaCl浓度下的PCR反应
G = H – T S
H 为焓值
T 为温度
S 为熵值
3 末端和内部的配对都能形成二级结构而3 末端封闭的二级结构对扩增效率的影响更
大考虑到这一点3 末端的二级结构自由能G值将减去1
单个引物评分Rating 公式
Rating = 100 - G Dimer 1.7 + G Hairpin 1.4 + G False Priming 1.5
评分100 - 二聚体G 1.7 + 发卡G 1.4 + 错配G 1.5
当引物搜索完成后一般很难判断可供选择的引物中到底哪些引物会有较好的扩增效果
PRIMER PREMIER 将根据引物二级结构的稳定性自动给引物评分并按评分排序如果引物
二级结构较稳定其评分就较低反之二级结构较不稳定评分就较高评分是根据引物形
成二级结构稳定性的热力学数据来计算这些数据在评分中占的权重系数是根据经验确定的
这些系数可以在Preferences窗口修改
引物对评分Rating 公式
Rating = Average of sense and anti-sense primer rating - Tm difference between
primers 1.7 - G Cross Dimer 1.3
评分正反引物平均评分Tm差异1.7 – 交叉二聚体G 1.3
引物对评分是根据正反引物的平均评分Tm差异和交叉二聚体自由能G计算的
附录B 多义碱基表
以下是软件可以识别的DNA中多义碱基的代码及含义